เริ่มตั้งแต่ปลายพุทธศตวรรษที่ 21 อาณาจักรอยุธยาถูกราชวงศ์ตองอูโจมตีหลายครั้ง สงครามครั้งแรกคือ สงครามพระเจ้าตะเบ็งชเวตี้ เมื่อ พ.ศ. 2091-92 แต่ล้มเหลว การรุกรานครั้งที่สองของราชวงศ์ตองอู หรือเรียกว่า “สงครามช้างเผือก”สมัยพระมหาจักรพรรดิ เมื่อ พ.ศ. 2106 พระเจ้าบุเรงนองทรงให้สมเด็จพระมหาจักรพรรดิยอมจำนน พระบรมวงศานุวงศ์บางส่วนถูกพาไปยังกรุงหงสาวดี และสมเด็จพระมหินทราธิราช พระราชโอรสองค์โต ทรงได้รับแต่งตั้งเป็นเจ้าประเทศราช เมื่อ พ.ศ. 2112 ราชวงศ์ตองอูรุกรานอีกเป็นครั้งที่สาม และสามารถยึดกรุงศรีอยุธยาได้ในปีต่อมา หนนี้พระเจ้าบุเรงนองทรงแต่งตั้งสมเด็จพระมหาธรรมราชาธิราชเป็นเจ้าประเทศราช

การฟื้นตัว
ภายหลังที่พระเจ้าบุเรงนองสวรรคตเมื่อ พ.ศ. 2124 สมเด็จพระนเรศวรมหาราชทรงประกาศเอกราชแก่กรุงศรีอยุธยาอีกสามปีให้หลัง อยุธยาต่อสู้ป้องกันการรุกรานของรัฐหงสาวดีหลายครั้ง จนในครั้งสุดท้าย สมเด็จพระนเรศวรมหาราชทรงปลงพระชนม์เมงจีสวา (Mingyi Swa) อุปราชาของราชวงศ์ตองอูได้ในสงครามยุทธหัตถีเมื่อ พ.ศ. 2135 จากนั้นอยุธยากลับเป็นฝ่ายบุกโดยยึดชายฝั่งตะนาวศรีทั้งหมดขึ้นไปจนถึงเมาะตะมะใน พ.ศ. 2138 และล้านนาใน พ.ศ. 2145 สมเด็จพระนเรศวรมหาราชทรงยกทัพเข้าไปในพม่าลึกถึงตองอูใน พ.ศ. 2143 แต่ทรงถูกขับกลับมา หลังสมเด็จพระนเรศวรมหาราชเสด็จสวรรคตเมื่อ พ.ศ. 2148 ตะนาวศรีตอนเหนือและล้านนาก็ตกเป็นของอาณาจักรตองอูอีกครั้งใน พ.ศ. 2157 อยุธยาพยายามยึครองล้านนาและตะนาวศรีตอนเหนือกลับคืนระหว่าง พ.ศ. 2205-07 แต่ล้มเหลว

การค้าขายกับต่างชาติไม่เพียงแต่ให้อยุธยามีสินค้าฟุ่มเฟือยเท่านั้น แต่ยังได้รับอาวุธยุทโธปกรณ์ใหม่ ๆ ด้วย โดยเฉพาะในรัชสมัยสมเด็จพระนารายณ์มหาราช อยุธยามีความเจริญรุ่งเรืองมาก[25] แต่กลับสูญเสียการควบคุมเหนือหัวเมืองรอบนอก ผู้ปกครองท้องถิ่นใช้อำนาจของตนอย่างอิสระ และเริ่มกบฏต่อเมืองหลวงมากขึ้น